Als Substrat oder Biogassubstrat wird der Rohstoff bezeichnet, der in einer Biogasanlage zur Erzeugung von Biogas genutzt wird. Insbesondere stark wasserhaltige Biomasse, die nicht direkt thermisch verwertet werden kann, eignet sich als Substrat. Biomasse, die reich an Cellulose (z. B. Stroh) und Lignocellulose (Holz) ist, ist für den mikrobiellen Abbau schlecht zugänglich und daher ohne vorherigen Aufschluss der Cellulose z.B. mit einem Schredder, als Substrat zur Biogaserzeugung nicht geeignet.
Häufig werden neben einem Hauptsubstrat weitere Rohstoffe eingesetzt, die als Cosubstrat cofermentiert werden. Insbesondere bei Biogasanlagen, die hauptsächlich mit Gülle betrieben werden, können Cosubstrate wie Fettabscheiderrückstände einen großen Anteil des Methanertrags liefern.
In Biogasanlagen werden sowohl nachwachsende Rohstoffe als auch Rückstände aus der Tierhaltung sowie biogene Abfälle als Substrat verwendet.
Prinzipiell eignen sich fast alle Stoffe organischer Herkunft zur Vergärung in Biogasanlagen. Je weniger Wasser und anorganische Substanz und je mehr leicht abbaubare Substanzen wie Fette, Proteine und Kohlenhydrate im Substrat sind, desto mehr Methan kann potenziell daraus entstehen. Der Anbau von Energiepflanzen für die Verwendung als Substrat ist attraktiv. Mais, Ganzpflanzensilage, Zuckerrüben und Grassilage zählen zu den am häufigsten eingesetzten Substraten. Mais ist der bedeutendste nachwachsende Rohstoff in der Biogaserzeugung. Mit Zuckerrüben können hohe Hektarerträge erzielt werden. Zudem ist die Abbaubarkeit in Biogasanlagen gut. Vor allem für viehlos wirtschaftende Betriebe des ökologischen Landbaus kann die Verwertung von Kleegrassilage attraktiv sein, da damit eine Gründüngung direkt erlösbringend verwertet wird und gleichzeitig mit dem Gärrest ein zeitlich flexibel einsetzbarer Dünger gewonnen wird.
Den frühen landwirtschaftlichen Biogasanlagen wurde Gülle als Hauptsubstrat eingesetzt. Sie fällt in viehhaltenden Betrieben an und steht in der Regel kostenlos zur Verfügung. Für Mist gilt ähnliches wie für Gülle. Die festere Konsistenz erfordert eine andere Rührtechnik im Fermenter, andererseits ist auch die Vergärung im Verfahren der Trockenfermentation möglich. Das enthaltene Stroh liefert keinen nennenswerten Beitrag zur Gasausbeute, da es vor allem aus Cellulose besteht, die in herkömmlichen Biogasanlagen kaum abgebaut wird. Durch eine sachgerechte Vergärung von Mist und Gülle können die Emissionen des stark klimaschädlichen Methans aus der Tierhaltung reduziert werden, zudem wirkt sich das Substrat anders als Einsatzstoffe aus nachwachsenden Rohstoffen nicht auf die Flächenkonkurrenz im Ackerbau aus.
